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                原代細胞的培養方法及注意事項

                更新時間:2023-06-29 點擊量:482
                原代細胞的培養方法及注意事項
                原代細胞培養,也稱初代培養,是將動物機體的各種組織從機體中取出,經各種酶(常用trypsin)、螯合劑(常用EDTA)或機械方法處理,分散成單細胞,置合適的培養基中培養,使細胞得以生存、生長和繁殖。
                原代培養的基本過程包括取材、 培養材料的制備、 接種及培養等步驟,原代培養的方法很多,基本和常用的是組織塊培養法和分離細胞法。
                1、組織塊培養法
                基本操作過程
                1)用培養液濕潤所取組織材料,并用鋒利的眼科剪將附在其上的脂肪和結締組織去除干凈。再用平衡液 (PBS )或 Hanks 液漂洗; 用鋒利的眼科彎剪將組織塊剪成小塊; 再用 PBS或 Hanks 液漂洗多次,直至液體不渾濁、無油滴、清亮為止。
                2)用濕潤的吸管吸取切碎的組織塊,輕輕吹到培養瓶皿中,并將其按一定間距均勻放在培養瓶底壁上,量不要過多,要將組織塊切面貼在培養瓶底壁上。
                3)將培養瓶翻轉,使瓶底朝上,在種植了組織塊一側的對側面加足培養液,勿使組織塊與培養液接觸,塞緊瓶塞。
                4)將種植了組織塊的一側朝上,靜置于 37℃培養箱中;待組織塊貼壁 1h 到 3h 后翻瓶,使貼壁的組織塊浸沒與培養液中,靜置。
                5)每隔 2 到 3 天更換一次培養液,或者根據培養瓶種顏色的變化確定換液時間。
                注意事項
                1)剛接種后,組織塊粘附不牢固,觀察和轉移過程中動作要輕,以防引起液體振蕩,使組織塊漂起。
                2)培養初期,要注意觀察有無細菌、霉菌污染。
                3)原代培養要及時觀察,記錄。
                4)過3-5天,需要換液以除去漂浮組織塊和殘留的血細胞,保證原代細胞正常生長。
                2、分離細胞培養法—貼壁型細胞培養
                基本操作過程
                1)首先用細胞分散法收獲細胞,隨時吸取少量消化液在鏡下觀察,并根據組織是否分散成細胞團或單個細胞,采取終止消化措施。用篩網濾掉未消化的組織塊。
                2)低速離心細胞懸液,棄掉上清液,加入含血清的培養液,輕輕吹打制成細胞懸液,計數并用培養液調整細胞密度。
                3)根據培養的細胞類型和實驗要求,用吸管吸取一定量的細胞懸液,加到培養瓶中。對于需要特殊底物的細胞,要先將底物涂一層于培養瓶皿底壁,然后接種細胞。
                4)將培養瓶放入 37℃恒溫箱中培養。
                5)每隔 2 到 3 天更換培養液一次或根據培養液顏色的變化確定換液時間。
                注意事項
                1)原代培養的分離細胞在初次接觸體外環境時,雖然被分散成單個細胞,但它們之間的互相影響還是存在的, 而且這種影響對細胞能否存活是非常重要的。在這些細胞之間能產生一些促生長的活性物質, 使細胞彼此互相促進存活和生長。如果接種的細胞密度過低, 細胞之間的促生長作用很小, 雖然營養物質很充足, 也很難使細胞適應從體內的組織環境到被分散后進入獨立生存環境的變化過程。 如果接種的細胞密度過大,會導致營養物質供應不足, 代謝廢物積累較快需要經常換液和傳代。
                2)原代培養時初始培養在組織分散和分離細胞時細胞可能會受到嚴重的損傷。適當增大原代培養接種的細胞密度, 給培養的細胞提供更多的類似于在體內時細胞之間的相互作用, 會極大提高原代培養的細胞在體外存活率。待細胞適應體外環境后進行傳代培養時再以較低的密度接種和培養。
                3)由于細胞之間的相互的內在聯系被打破,分離細胞在體外培養時經歷的生存環境改變很大,在體外存活和生長的難度相應增加。 對于貼壁依賴性細胞來說,盡快使接種的細胞貼壁,是決定培養能否成功的關鍵??梢栽诮臃N后先將培養瓶置培養箱內培養 3h 到 5h,由于細胞懸液中帶有少量培養液, 細胞即可以維持存活, 又可以很快接觸到培養瓶底壁, 是細胞迅速黏附于底物,待細胞貼壁后,再補足培養液繼續培養。
                3、分離細胞培養法—懸浮型細胞培養
                操作過程
                1)制備細胞懸濁液,計數并用培養液調整細胞密度。
                2)在培養皿中加入足夠的培養液。
                3)將欲接種的細胞接種到培養器皿中。
                4)在培養皿內放入一個有聚四氟乙烯包被的磁棒。將培養皿封口,送入恒溫箱內。在磁力攪拌器上邊攪拌邊培養。若接種培養瓶或試管中,封口后可將培養器皿固定在恒溫搖床上,邊搖動邊培養,無需放置磁棒。有些細胞也可以不用磁棒或磁力攪拌器,也不必使用恒溫搖床,接種于預先用硅脂包被的培養器皿內直接在培養箱中靜置培養即可。
                5)培養液略呈黃色換液。吸出部分舊培養液,加入新鮮培養液即可。
                注意事項
                1)進行懸浮細胞培養時必須保持細胞的懸浮狀態??梢酝ㄟ^增加培養液的黏度來幫助細胞呈懸浮狀態,如給培養液中加入低濃度的透明質酸復合物。在有攪拌裝置的培養器皿內加入培養液是,以 5ml 為限度,否則攪拌時會產生氣泡對細胞造成傷害。使用這種方式需注意勿使攪拌速度過快, 否則即可使培養液溢出又容易造成污染。 如果培養液的量在 5ml 以下,可以采用旋轉瓶培養。給懸浮培養的細胞換液時要注意不要吸出細胞。
                2)能夠進行懸浮培養的細胞,其生命力一般都比較旺盛,體外分裂增殖的速度較快,營養成分消耗大,換液時間隔一般較短。
                原代培養的注意事項
                1)在原代培養的 1 天到 2 天內,要特別注意觀察是否有細菌、真菌的污染,一旦發現,要及時清除,防止造成其它細胞的交叉感染;
                2)隨著培養的進程,培養液中的營養物質被逐漸的消耗,營養成分越來越少,細胞代謝產物越來越多,有細胞呼吸過程中釋放出來的 CO 2 及其它產物如乳酸、丙酮酸等也逐漸增加。隨著酸性物質的增加,培養液中的 pH值越來越低,培養液的顏色也越來越黃。因此,在細胞培養的過程中,要注意培養液顏色的變化,并根據培養液的顏色來決定換液時間。正常情況下,培養液呈桃紅色;當培養液呈橙黃色時,細胞一般生長情況良好;呈淡黃色時,可能培養時間較長,營養不足,死亡細胞較多;呈紫紅色時, 可能是細胞生長狀態不好或已經死亡。所以, 應在培養液略黃時吸出部分舊培養液, 然后補加同等數量的新鮮培養液。換液過程中,不要吸出細胞,不要使培養液溢出培養瓶,避免各種微生物的污染。換液時,應將培養液事先預溫至 37℃。
                一般培養一天,組織細胞即可在培養瓶皿底壁黏附并貼壁生長。 2 天到 3 天后,細胞恢復增殖活動。隨著培養時間的延長,細胞數量逐漸增多, 消耗的營養物越來越多, 需要換液的時間越來越短,當細胞逐漸長滿培養瓶壁并形成一單層細胞時,細胞之間相互發生接觸和聯系,逐漸產生接觸抑制作用,培養物生長速度減慢。 當培養物最后形成一層完整的細胞單層時,生長幾乎停止。在細胞高達 80%融合時就需要進行傳代了。
                原代細胞培養實驗注意事項詳解
                1)原代培養材料的選擇,盡量選取繁殖能力較強的組織,如胚胎、幼小的生物體或者腫瘤組織等。
                2)要注意無菌操作。其操作要求應高于外科手術
                3)整個取材操作要迅速,尤其孕鼠浸泡乙醇時間1min左右,不能過長,以確保胚胎細胞活性。
                4)運用消化法時Pancreatic enzymes溫度應低于37℃,濃度只需平時消化細胞濃度的一半。因為此過程不像消化培養細胞時的1~10min,而是至少20min,先消化下來的細胞在此Pancreatic enzymes消化液中繼續消化了10min以上。所以Pancreatic enzymes不能作用過強,否則這些細胞易被損傷而不易生存。
                5)如使用組織塊法,則應待組織塊略干燥,能黏附于瓶壁時再使之與培養液接觸,匆使組織塊漂浮起來。如果組織塊沒有黏壁,則細胞不易生長,即使生長也因沒有貼在瓶壁上,從而因不能觀察到而無法收集到生長的細胞。
                6)原代培養操作時,也可以使用未添加血清的DMEM或PBS洗滌子宮、胚胎或組織塊等。
                7)本實驗也可以使用新生乳鼠做培養材料。此時要將乳鼠浸入75%乙醇2~3min使皮膚充分消毒,由于乳鼠原代培養污染概率更高,故應小心操作,避免污染細菌。乳鼠原代培養細胞的存活率不及胚胎細胞培養的成功率。


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